A epigenética, é um termo que significa “acima do genoma”, consiste no estudo das alterações na expressão de genes específicos que não dependem de mudanças na sequência primária do ácido desoxirribonucléico (DNA), mas que envolvem modificações estruturais na cromatina decorrentes da interação do indivíduo com o ambiente. A estrutura da cromatina consiste na dupla fita de DNA em espiral que enrola em torno de um octâmero proteico formado por quatro pares de histonas: H2A, H2B, H3 e H4, conforme observado na Figura 1. Assim os mecanismos epigenéticos englobam modificações tanto na molécula de DNA quanto nas histonas.
2. Modificações epigenéticas em DNA
O DNA é suscetível a uma única modificação: a metilação, reação catalisada por enzimas denominadas DNA metiltransferases (DNMTs). A metilação ocorre preferencialmente nas chamadas ilhas citosina fosfato guanina (CpG), regiões do DNA com grande número de resíduos de Citosina e Guanina adjacentes localizados na região promotora de vários genes, (conforme ilustrado na Figura 2) e está associada à repressão gênica. As DNMTs transferem o grupo metil da molécula doadora S-adenosilmetionina (SAM) para a posição 5’ do anel piramidal da citosina, formando 5-metil desoxicitidina e S-adenosil homocisteína (SAH). Há duas famílias de DNMTs: as DNMTs de manutenção, responsáveis por manter os padrões de metilação durante o processo de replicação celular, incluindo DNMT1, que utiliza como substrato DNA hemimetilado, e as DNMTs com função de metilação propriamente dita dos genes (mecanismo denominado como “de novo metilação”), as DNMT3A e DNMT3B, as quais estão envolvidas na transferência de grupos metil para sítios previamente não metilados.
Uma das propostas para explicar os possíveis mecanismos envolvidos com a repressão gênica mediada pela metilação do DNA seria através da diminuição direta da transcrição por meio do bloqueio dos fatores de transcrição aos seus sítios de ligação, além do papel das proteínas conectoras de metil-CpG, que reconhecem e se ligam ao DNA metilado. Destas, a mais conhecida é a MECP2 (Proteína 2 de ligação a metil-CpG).
Os processos de desmetilação ativos envolvem mecanismos de reparo por excisão de nucleotídeos e de bases e também por um complexo sistema enzimático, no qual a desmetilação do DNA é iniciada pela oxidação do 5-mC em 5-hidroximetilcitosina (5-hmC) por proteínas metilcitosina desoxigenase (TET), está sendo elucidado. A 5-hmC é geralmente associada a uma maior atividade gênica, entretanto Jin et al. (2011) descreveram que o conteúdo e a localização no gene alteram o papel sobre a transcrição. A 5-hmC está presente em vários tipos celulares, com altos níveis no encéfalo, especialmente nas células de Purkinje cerebelares. As enzimas TET podem transformar 5-hmC em 5-formilcitosina e 5-fC a em 5-carboxilcitosina.
3.Do ambiente ao gene
Para muitos, pode ser uma surpresa descobrir que o ambiente externo afeta os genes, modulando sua atividade. O efeito gênico do ambiente não é direto. As influências ambientais são mediadas por alterações nas células em que os genes residem. Diferentes tipos de célula reagem de forma diversa ao mesmo fator ambiental, seja ele estresse social ou carência alimentar no útero materno. Por sua própria natureza, e apesar do fato de os genes de todas as células do corpo serem os mesmos, os efeitos ambientais são sempre específicos para cada tipo de célula.
As células do fígado reagirão de uma maneira às carências nutricionais, os neurônios reagirão de outra, e muitos tipos de célula nem apresentam reação. Assim, ao determinar qualquer influência ambiental sobre o funcionamento dos genes, os cientistas se fixam em populações celulares específicos, como os neurônios de determinada área do cérebro, as células do fígado, do pâncreas ou de algum outro órgão. É fácil perceber que a fome holandesa afetou muitos tipos de células diferentes nos indivíduos expostos. Alguns foram afetados no cérebro, outros no coração, no fígado ou no pâncreas etc. Se comparássemos, digamos, as células hepáticas do grupo atingido pela fome com as de indivíduos não atingidos, provavelmente encontraríamos padrões diferentes de atividade gênica.
Alguns genes nas células do fígado dos afetados se mostrariam mais ativos e outros menos ativos que nas dos não afetados. A meta inicial é identificar quais são exatamente os genes dessas células cuja atividade é alterada pela carência alimentar durante a gestação. Depois, que é estabelecer um nexo causal entre as atividades gênicas alteradas nas células hepáticas e o diabetes, ou qualquer outra condição que queiramos explicar.O controle da atividade dos genes numa célula é chamado de regulação gênica (Figura 3).
Os genes epigeneticamente regulados podem ser identificados por marcações características que aparecem sob a forma de apêndices químicos específicos. O tipo mais comum desses apêndices envolve o grupo metila, constituído por um átomo de carbono ligado a três átomos de hidrogênio (CH3). Quando um gene está ligado a grupos metila, diz-se que ele está metilado. Esse fenômeno não é uma questão de tudo ou nada, os genes podem apresentar diferentes graus de metilação. Em geral, quanto mais metilado, menos ativo é o gene.
4. Modulação Epigenética nas Doenças Respiratórias
Nas doenças respiratórias, as vias aéreas são expostas não somente aos poluentes externos como também ao estresse celular gerado pelo processo inflamatório e pela resposta imunológica. Este estresse pode acarretar alterações no epigenoma, o que consequentemente impacta na etiologia e na progressão das referidas enfermidades. Ainda, tem sido descrito que a exposição intrauterina e pós-natal, como o tabagismo, afeta diretamente a severidade do quadro clínico dessas doenças, o que também está associado à alteração de marcadores epigenéticos.
Serão descritos os mecanismos epigenéticos vinculados à fisiopatologia e progressão de duas importantes doenças respiratórias crônicas: a Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) e a Asma. Vale ressaltar que ambas apresentam sintomatologia e fisiopatologia semelhantes, sendo caracterizadas por obstrução ao fluxo aéreo.Contudo,em indivíduos com DPOC, na maioria das vezes, essa obstrução é irreversível enquanto que em asmáticos, isso ocorre em resposta à exposição a alérgenos, sendo a crise, normalmente, reversível com a retirada do fator causador.
5. Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC)
A DPOC vem se tornando uma doença de impacto global, apresentando uma prevalência superior a 10% no mundo. A Organização Mundial de Saúde (OMS) tem demonstrado que a DPOC causa aproximadamente três milhões de mortes/ano, representando uma das principais causas de mortalidade e morbidade nos dias de hoje.A OMS prevê que no ano de 2030 a mortalidade por DPOC passará de quarto lugar no ranking de morte por todas as causas para a terceira posição, vindo logo atrás de outras patologias como a doença arterial coronariana e o acidente vascular encefálico. Assim, o estudo dos aspectos etiológicos e fisiopatológicos da doença bem como estratégias preventivas e terapêuticas para a DPOC são essenciais.
Sabe-se que a exposição ao tabaco é o principal fator de risco associado ao desenvolvimento da patologia, porém, diversos outros fatores são causas importantes e preveníveis da doença. Conforme a Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisiologia, o desenvolvimento da DPOC se dá através de alguns fatores de risco específicos, classificados em dois grupos: os fatores externos e os individuais, conforme observado na tabela 1.
Tabela 01. Fatores de risco para o desenvolvimento da DPOC.
No perfil fisiopatológico da DPOC, pode-se observar que o sistema surfactante é demasiadamente afetado pela destruição do parênquima pulmonar, dificultando, desta forma, que as trocas gasosas ocorram (Figura 4). Sendo assim, existe a perda da elasticidade pulmonar, ensejando um acúmulo de secreção. Esse quadro acarreta na obstrução do fluxo aéreo e, consequentemente, aumenta a capacidade residual funcional, ocasionando um quadro de hiper insuflação pulmonar e piorando a relação tensão/comprimento muscular diafragmático.
Isto causa importante declínio da capacidade muscular de gerar força. Além da disfunção respiratória, ocorrem comprometimentos em outros órgãos como: ossos, sistema cardiovascular e músculo esquelético. A disfunção muscular de membros inferiores atinge aproximadamente um terço dos pacientes mesmo em fases precoces da patologia quando a obstrução das vias aéreas ainda não é considerada grave, o que pode contribuir para o comprometimento da capacidade funcional e estilo de vida sedentários desses indivíduos.
Em nível molecular, evidencia-se a ativação de células inflamatórias e de marcadores epigenéticos. Especificamente, observa-se alteração dos níveis de metilação do ácido desoxirribonucleico (DNA) e redução dos níveis de acetilação de histonas em diversos tecidos como o pulmonar, sangue periférico e músculo esquelético, conforme será abordado a seguir. Alterações nos níveis de metilação de DNA são observadas em tecido pulmonar de pacientes com DPOC. Um perfil de hipermetilação em alguns loci e hipometilação em outros é constatado nesses pacientes, o que está associado à diminuição da transcrição de genes protetores e ao aumento da transcrição de genes promotores dessa doença, levando a um prognóstico mais negativo. Assim, a hipermetilação das ilhas citosina fosfato guanina (CpG) visa estabelecer um antagonismo entre uma via protetora e uma via promotora da patologia da DPOC.
A hipometilação do gene promotor de histona deacetilase 6 (HDAC6), por exemplo, determina um aumento da expressão de HDAC6 em macrófagos alveolares. Esse processo contribui para a disfunção epitelial mediada pelo cigarro, através da promoção de autofagia. Além disso, a fumaça de cigarro pode estar associada a alterações na expressão de DNA metiltransferases (DNMTs) e a modificações na metilação de ilhas CpG na estrutura dinâmica do DNA em pacientes com DPOC, participando diretamente da piora do quadro clínico. A hipermetilação de genes específicos, como fator de coagulação II (trombina) receptor-like 3 (F2RL3) e receptor acoplado à proteína G (GPR15), mostrou estar associada não só ao tabagismo atual, mas também ao tempo de dependência do cigarro, apresentando relação dose resposta. Ainda, foi relatado que o tabagismo diminuiu a expressão de genes protetores. Tsaprouni et al. (2014) relataram uma hipometilação de DNA em sangue periférico, a qual foi apenas parcialmente reversível após a cessação do tabagismo, sugerindo que o cigarro induz a alterações reversíveis em marcadores epigenéticos nessa população. Chen (2012) observaram que pacientes com carga tabágica maior que 40 maços-ano apresentaram maior atividade da enzima HDAC quando comparados a indivíduos com menos de 40 maços-ano.
Com isso, foi estabelecida uma correlação positiva entre a atividade da HDAC e o tabagismo em pacientes com DPOC. Assim, evidencia-se que o tabagismo é um importante modulador de marcadores de acetilação de histonas e metilação de DNA em indivíduos com DPOC. O tabagismo e o estresse oxidativo diminuem também a atividade da enzima HDAC2 em macrófagos presentes em tecido pulmonar, o que promove a persistência do processo inflamatório em pacientes com DPOC devido à diminuição de citocinas anti-inflamatórias e ao aumento das pró-inflamatórias. Neste sentido,a redução da expressão de HDAC aumenta a acetilação global do gene promotor da interleucina 8 (IL-8), a qual apresenta atividade pró-inflamatória. Esse perfil molecular contribui para a resistência à terapia farmacológica com corticosteroides e está diretamente ligado à gravidade da doença e evolução do quadro clínico. Alguns estudos têm sugerido que pacientes com DPOC, independentemente do tabagismo atual, possuem a atividade da HDAC diminuída em macrófagos alveolares, e esta condição se encontra relacionada com a gravidade das limitações do fluxo aéreo. Esses achados corroboramos de Marwick(2004) que observaram, em macrófagos alveolares de tabagistas, uma redução da atividade da HDAC e na expressão da HDAC2, estando diretamente relacionada com o aumento da liberação de citocinas inflamatórias como fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e IL-822. Modificações epigenéticas no gene guanina-adenina-timina-adenina 4 (GATA 4), que se encontra associado com a função e o desenvolvimento do sistema cardiopulmonar, também foi relacionado com o estado de saúde geral de pacientes com DPOC.
Em um estudo experimental, foi observado que camundongos com deficiência nesse gene específico morrem no útero devido às anormalidades significativas na formação do sistema cardiovascular. Em estudo com humanos, foi descrito que o GATA 4 é fundamental para o desenvolvimento dos lobos pulmonares. Por outro lado, a mutação desse gene específico está associada com disfunções cardíacas congênitas e insuficiência das valvas cardíacas. Outro estudo mostrou que os pacientes com DPOC apresentam metilação do gene GATA 4, indicando uma redução na sua transcrição e expressão quando comparado com o grupo controle. Desta forma, os autores sugerem que o estado de metilação do gene GATA 4 pode ser um preditivo para avaliar o estado de saúde dos pacientes com DPOC. Como já comentado, a disfunção muscular esquelética é uma manifestação sistêmica presente na maioria dos pacientes com DPOC, principalmente em estágios mais avançados da patologia. Neste contexto, uma pesquisa recente relatou um aumento significativo nos níveis da HDAC4 em músculo vasto lateral de pacientes com essa doença.
6. Asma
A asma é uma doença com alta incidência na população em geral, acometendo principalmente os indivíduos em fases iniciais de suas vidas, configurando um sério problema de saúde pública. Na maioria dos casos, o início dos primeiros sintomas da doença ocorre antes dos 5 anos de vida, com prevalência maior no sexo masculino(relação 2:1). Já em adultos, essa prevalência tem tido um aumento nos últimos anos, estimando-se entre 5 e 10%,principalmente em países industrializados (Barnes, 1998).
Numerosas exposições pré-natais, como a asma materna ou atópica, desnutrição ou a obesidade gestacional, estresse materno durante a gravidez e a exposição a poluentes possuem forte influência sobre futuras doenças respiratórias, tanto para o feto quanto para a mãe. Entre esses, o tabagismo materno durante a gravidez é um dos fatores de risco mais importantes para o desenvolvimento da função pulmonar prejudicada e risco de asma (Upton e Svanes, 2014).
A fisiopatologia da asma é complexa e caracterizada pela obstrução variável das vias aéreas, a qual é ocasionada pela hiper-reatividade brônquica, edema e inflamação das mesmas (Figura 5). Vale ressaltar que tal condição é centrada em dois aspectos: a inflamação e a remodelação das vias (Anerud, 2015).A inflamação das vias aéreas é um fator importante no desenvolvimento do quadro asmático.A presença de edema e o acúmulo de secreção contribuem para a obstrução das vias, acarretando na hiper-reatividade brônquica e dificultando a passagem de ar.
Os alérgenos, nas vias aéreas, ativam o aparecimento de mediadores inflamatórios provenientes dos macrófagos e demais células (Lepori, 2014), o que, juntamente com alterações dos níveis de marcadores epigenéticos, contribuem para o início e a evolução do quadro clínico (Comer, 2015).
Especificamente, observa-se alteração dos níveis de metilação do DNA e na atividade/concentração nas enzimas histona acetiltransferase (HAT) e HDAC evidenciadas principalmente em tecido pulmonar. Foi mostrado, em um estudo de coorte com 157 crianças comidade entre 2 e 10 anos, que o manuseio de animais bem como a exposição à fumaça de cigarro aumentam os níveis de metilação de DNA no marcador CD14 (glicoproteína). Isso explica, em parte, o entendimento das divergentes associações de alelos do marcador CD14 e sua relação com doenças alérgicas detectadas em diferentes ambientes através da modulação epigenética (Munthe-kaas, 2012). Em alguns doentes asmáticos graves, as células mononucleares do sangue periférico perdem plasticidade fenotípica, não conseguindo responder de forma adequada aos corticosteroides. Essa resistência ao uso de corticosteroides inalados tem sido associada ao aumento da expressão do fator de crescimento de colônias de macrófagos e granulócitos (GMCSF) e liberação de citocinas pró-inflamatórias, como o interferon-gama (IFN-γ), parcialmente devido à desregulação entre as concentrações de histona acetiltransferase (HAT) e HDAC (Hew, 2006). Desta forma, assim como ocorre na DPOC, o tratamento da asma com corticoesteroides modula marcadores epigenéticos.
A atividade da HDAC também é atribuída à resistência de fibroblastos pulmonares, percebida em patologias pulmonares fibróticas apoptóticas, tais como fibrose pulmonar intersticial e asma (Kidd, 2016), o que possivelmente leva a uma diminuição da expressão de genes protetores. A função da HDAC1 é essencial para que ocorra uma reparação e remodelação do epitélio das vias aéreas, bem como para o crescimento de células epiteliais, associando-se com a evolução do quadro clínico para asma grave uma vez que a atividade dessa enzima se encontra relacionada com a resistência a fármacos esteroides (Butler, 2012). O aumento e a remodelação do epitélio das vias aéreas estão associados com a gravidade da patologia, sendo constatada uma intensidade de sua atividade em pacientes com asma grave em comparação a pacientes com asma moderada (Wang, 2013). Sendo assim, a atividade da HDAC1 pode representar um importante biomarcador para distinguir a severidade dessa condição clínica.
A atividade da HAT também é alterada em tecido pulmonar de asmáticos. Esta se encontra aumentada tanto em biópsias pulmonares de adultos quanto em crianças (Ito, 2002 e Su,2008). Com base nesses achados, evidencia-se que o desequilíbrio HAT/HDAC está vinculado à gravidade e intensidade dos sintomas da asma previamente descritos.
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