O isolamento do DNA (Ácido Desoxirribonucleico) é um procedimento fundamental e necessário para a realização das outras técnicas moleculares. A extração consiste basicamente na (1) obtenção do material biológico podendo ser: vírus, bactérias, células vegetais ou animais, (2) na lise celular, que envolve a ruptura da célula para acessar o DNA, (3) na purificação, remoção dos restos celulares e (4) precipitação dos ácidos nucléicos. Atualmente, existem kits comerciais que permitem a extração do material genético de qualquer tecido ou células com elevado grau de pureza e maior rapidez.
2. Eletroforese
A eletroforese tem como principal objetivo a separação de biomoléculas, com base nas propriedades elétricas e de massas. A eletroforese em gel é realizada em um suporte de matriz gelatinosa que possibilita a passagem de íons e o deslocamento de moléculas carregadas. O suporte pode ser do tipo gelatina, como a agarose, ou do tipo polímero, como a poliacrilamida. Para que os fragmentos de DNA sejam visualizados, o gel deve ser submetido à coloração, em geral, com corantes como brometo de etídio, que se intercala na estrutura do DNA e se torna fluorescente em presença da luz UV.
A migração de uma molécula de DNA fita dupla na eletroforese e uma relação de tamanho, sendo que as moléculas menores migram mais rapidamente que as maiores. O tamanho de uma molécula de DNA é uma medida do número de pares de bases que o forma.
3. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Descrita por Kary Mullis, no final dos anos 80, a reação em cadeia da polimerase, mais conhecida pela sigla PCR (Polymerase Chain Reaction), explora a capacidade de replicação in vitro, sendo um método simples e rápido para a amplificação de um segmento específico de DNA.
A técnica de PCR baseia-se em três passos: desnaturação, anelamento e extensão. O primeiro passo, a desnaturação, consiste no rompimento das pontes de hidrogênio entre as duas fitas de DNA, sendo essencial expor a amostra à 94ºC. O segundo passo, o anelamento, permite que os primers se liguem a sequências complementares no DNA genômico, nesta fase a temperatura varia de 50-60ºC. Por fim, o terceiro passo, a extensão, ocorre à 72ºC, nesta etapa a DNA polimerase, atua na síntese de novas fitas de DNA. As alternâncias de temperatura ocorre em média de 30 a 35 vezes com auxílio do termociclador.
Em relação aos reagentes necessários, a PCR depende de DNA genômico, dNTPs, enzima DNA polimerase, oligonucleotídeos (primers) e solução-tampão. A enzima escolhida para atuar no processo é a DNA polimerase da bactériasThermusaquaticus, conhecida como taq polimerase, que apresentam uma elevada termoestabilidade. Essa descoberta impulsionou a realização da PCR, visto que antes da taq polimerase, usava-se a DNA polimerase da E. coli, que a cada etapa da desnaturação era preciso ser reposta.
Figura 03. Página 268. Gráfico de temperatura relacionado com as etapas da PCR. Fonte: Genética Essencial. PIMENTEL, M.
Resumidamente, essa é a técnica de PCR, passo-a-passo:
1. A amostra de DNA, a enzima que faz a replicaçào (taq DNA polimerase), os nucleotídeos de DNA e os primers são colocados em um tubo de ensaio.
2. O tubo de ensaio é colocado em um termociclador. Os passos seguintes, de aquecimento e resfriamento, acontecem dentro deste equipamento.
3. O tubo é aquecido a 94ºC para separar (desnaturar) a dupla fita de DNA.
4. Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de molde para a síntese de novas fitas. Para isso, resfria-se a 54ºC onde os primers se anelam ao início das duas fitas simples.
5. O tubo é aquecido novamente a 72ºC para a duplicação da fita.
Figura 04. Página 269. Representação da PCR. Fonte: Genética Essencial. PIMENTEL, M.
4. Sequenciamento de DNA
O conhecimento da sequência correta de nucleotídeos de um fragmento de DNA se tornou uma etapa indispensável na pesquisa em genética. Atualmente, com as técnicas mais desenvolvidas e sofisticadas, o sequenciamento vem se tornando mais acessível, e como consequência, estudos com genoma e sua variabilidade tem aumentado.
O primeiro método de sequenciamento rápido foi o plus-minus, desenvolvido em 1977 e utilizado no sequenciamento completo do primeiro organismo. Outro método conhecido como Maxam-Gilbert, que consiste na modificação química das purinas e pirimidinas de moléculas de DNA marcadas radioativamente, seguida de clivagem, resultando na formação de fragmentos de diferente tamanhos. Os fragmentos são separados por eletroforese e reconhecidos por meio de autorradiografia.
Apesar do sucesso, o método Maxam-Gilbert foi suplantado pelo método enzimático, desenvolvido pela equipe do Dr. Sanger, que se baseia na síntese de uma fita de DNA a partir do DNA-molde a ser sequenciado. Muitos foram os avanços realizados pelos pesquisadores na utilização da metodologia de sequenciamento em eletroforese capilar com base na técnica de Sanger. Entretanto, tornou-se necessário obter grande quantidade de dados, incluindo a determinação de genomas completos. Deu-se início, então, à corrida para o desenvolvimento de métodos mais rápidos, baratos e confiáveis.
Assim, iniciou-se a era da genômica, cujo ápice científico foi a determinação da sequência do genoma humano em 2003. O sucesso alcançado neste projeto está relacionado ao desenvolvimento de novos vetores de clonagem, sequenciadores com maior desempenho e análise de dados por computadores mais potentes.
5. Marcadores moleculares
Para a descrição e identificação do DNA são necessárias tecnologias de análise molecular que permitem determinar pontos de referências nos cromossomos, tais tecnologias são conhecidas como marcadores moleculares. Por marcadores moleculares define-se qualquer fenótipo molecular originado de um gene expresso ou de um segmento específico do DNA.
As diferentes metodologias da genética molecular têm permitido estudos de evolução, de diversidade genética, de identidade, origem genética e identificação de novas variantes.
Existem vários questionamentos sobre o uso apropriado dos marcadores moleculares, incluindo questões metodológicas de obtenção e análise dos marcadores genéticos. Para a obtenção de marcadores genéticos-moleculares, é exigida uma infra-estrutura apropriada para realizar as diferentes fases da metodologia. De modo geral, são necessários equipamentos para a extração de DNA, amplificação via PCR, separação por eletroforese, fotodocumentação e análise estatística dos marcadores gerados.
Cada tecnologia apresenta vantagens e desvantagens, o uso de uma ou de outra vai depender, entre outros fatores, do objetivo do estudo, infra-estruturadisponível, recursos financeiros e nível de conhecimento da genética molecular da espécie a ser estudada.
5.1 Principais marcadores genéticos
Isoenzimas – grupo de múltiplas formas moleculares de uma enzima, resultante de variações alélicas dos genes codificadores. As principais vantagens dessa técnica ao o baixo custo, a facilidade e rapidez da metodologia. As principais desvantagens são o baixo número dos sistemas enzimáticos polimórficos e a influência das condições ambientais e dos tecidos vegetais nas atividades enzimáticas.
RAPD (RandomAmplifiedPolymorphic DNA) - RAPDs são fragmentos de DNA amplificados pela PCR utilizando primers curtos de sequencia aleatória. As principais vantagens da técnica são a facilidade e a rapidez de obtenção de marcadores, a necessidade de quantidades mínimas de DNA e a universalização das analises. As principais desvantagens referem-se à dominância dos marcadores, não diferenciando os locos em heterozigose dos locos em homozigose e à baixa reprodutibilidade das marcas por causa da sensibilidade da tenica às condições experimentais.
RFLP (RestrictionFragmentLengthPolymorphism) – RFLPs são fragmentos de DNA obtidos de enzimas de restrição, separados por eletroforese, e visualizados por meio de hibridização com sondas de sequências homologas marcadas com radioatividade ou fluorescência. As principais vantagens da técnica são a co-dominância dos marcadores e a alta reprodutibilidade deles. As desvantagens são a exigência de grande quantidade e a qualidade do DNA a ser analisado, necessidade de sondas especificas para a hibridização e o fato de a técnica ser mais trabalhosa, demorada e cara comparada a outras técnicas.
Microssatélites – são unidades muito curtas repetidas em tandem, ou seja, uma após a outra. São conhecidos também como SSR (SimpleSequenceRepeats). As principais vantagens são a co-dominância dos marcadores, o alto nível de polimorfismo que pode ser detectado, a alta reprodutibilidade das marcas e a possibilidade de detecção de vários microssatélites no mesmo gel facilitando a operacionalização das análises. As principais desvantagens são o alto custo requerido no desenvolvimento de primers específicos, quando eles não estão disponíveis para a espécie a ser estudada, e o fato de bandas especificas ou géis de baixa resolução poderem dificultar a acurada avaliação de polimorfismo.
AFLP (AmplifiedFragmentLengthPolymorphism) – os AFLPs são fragmentos de DNA obtidos com a digestão do DNA com enzimas de restrição, seguidos da ligação de oligonucleotideos adaptadores e amplificação seletiva dos fragmentos via PCR. As principais vantagens dos AFLPs são a geração de grande numero de polimorfismo por reação e o fato de não haver necessidade de conhecimento prévio de dados de sequência de DNA para a construção de primers utilizados. As principais desvantagens são a dominância dos marcadores, o alto custo e as varias etapas e reagentes necessários à obtenção dos marcadores.
Minissatélites – são unidades de 10 a 100pb repetidas em tandem, flanqueadas por sítios conservados de endonucleases de restrição. Também são conhecidos por VNTRs (VariableNumberof Tandem Repeats). As principais vantagens desse marcador são a alta reprodutibilidade das marcas e a geração de muitas bandas informativas por reação. As desvantagens são relacionadas à dominância dos marcadores e ao fato de a técnica ser mais trabalhosa, demorada e cara, à semelhança dos marcadores RFLP.
CAPS (CleavedAmplifiedPolymorphicSequence) – CAPS são fragmentos de DNA amplificados via PCR, utilizando-se de primers específicos, seguido da digestão com endonucleases de restrição. As principais vantagens são a co-dominância e a alta reprodutibilidade dos marcadores e a principal desvantagem é a necessidade de conhecimento prévio de sequência de DNA para a construção dos primers.
SSCP (Single-StrandConformationPolymorphism) – são fragmentos de DNA amplificados por PCR usando primers específicos. As principais vantagens dos SSCPs são a baixa quantidade de DNA requerida para as analises e a co-dominancia dos marcadores. As desvantagens são a necessidade do conhecimento prévio de sequencia para a construção dos primers e a falta de reprodutibilidade quando as condições da eletroforese não estão bem padronizadas.
ISSR (Inter SimpleSequenceRepeats) – são fragmentos de DNA amplificados por PCR usando um único primer construído a partir de sequencia de microssatélites. As principais vantagens são a geração de grande numero de bandas informativas por reação e o fato de não haver a necessidade de conhecimento prévio de dados de sequencia de DNA para a construção do primer utilizado. A principal desvantagem é a dominância dos marcadores.
PCR-sequencing – esse tipo de marcador genético-molecular envolve a determinação da sequencia de nucleotídeos do fragmento de DNA amplificado via PCR utilizando primers específicos para cada região do genoma estudado. As principais vantagens é a alta reprodutibilidade e a principal desvantagem é o baixo nivel de variação em estudo intra-especifico, alem do custo da técnica.
SNP (Single NucleotidePolymorphism) - são marcadores moleculares utilizados para identificar mutações e polimorfismos baseados na posição de um único nucleotídeo. A principal vantagem, em comparação com outros marcadores, é a possibilidade de detecção de grande quantidade de polimorfismos entre alelos de determinado gene. A principal desvantagem é a necessidade do conhecimento prévio de sequencia do gene de interesse e o custo/infra-estrutura da técnica envolvida nas etapas necessárias ao seqüenciamento dos diferentes fragmentos de DNA.
5.2 Principais aplicações dos marcadores genéticos
Os marcadores genéticos-moleculares permitem gerar grande quantidade de informações sobre a identidade genética, a diversidade e a freqüência gênica. Os marcadores podem auxiliar nas diferentes etapas, como a coleta, manutenção, caracterização, manejo, ampliação e uso dos recursos genéticos.
As informações moleculares podem complementar as informações ecológicas, morfológicas e agronômicas dos recursos genéticos, contribuindo para aumentar a eficiência dos processos de coleta, direcionar o enriquecimento da base genética, analisar a diversidade e pureza genética, identificar acessos duplicados, auxiliar trabalhos de classificação botânica e filogenia, subsidiar a seleção de genitores, entre outros.
5.3 Princípio da Análise dos Marcadores Genético-Moleculares
Embora exista um grande número de marcadores genético-moleculares, o principio da analise desses marcadores é o mesmo: marcadores comuns aos acessos significam semelhança genética e marcadores não-comuns significam diferenças genéticas. Os dados sobre semelhança e diferença genética entre acessos de determinado banco de germoplasma permitem gerar grande quantidade de informações sobre a diversidade genética e relacionamentos filogenéticos entre eles.
Para a análise dos marcadores genético-moleculares é a codificação dos fragmentos moleculares em dados binários ou dados de coincidência alélica. Os dados para marcadores dominantes são codificados como 1 (presença de marcador) ou 0 (ausência de marcador). Para os co-dominantes são codificados como 0 (ausência de alelos comuns no loco), ½ (um alelo comum no loco) e 1 (os dois alelos comuns no loco).
Exercícios
1. Cite algumas vantagens dos marcadores moleculares sobre os marcadores morfológicos.
2. Sobre a eletroforese de DNA, écorretoafirmar que
01) é realizada utilizando-se uma placa com gel especial, fragmentos de DNA e aplicação de corrente elétrica.
02) os fragmentos de DNA que possuem cargas negativas se deslocam para o polo positivo, quando é aplicada uma descarga elétrica na placa de gel. 04) a eletroforese de DNA tem sido utilizada para a identificação de pessoas, nas investigações policiais, em processos judiciais e na determinação da paternidade.
08) gêmeos monozigóticos podem ser distinguidos pela análise do DNA nuclear.
16) os fragmentos separados por eletroforese são formados por DNA com cadeia dupla.
3. Com relação à Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), julgue os itens abaixo e, em seguida, assinale a opção correta.
I – Na PCR, a região do DNA que deverá ser amplificada é demarcada pelo oligonucleotídeo iniciador e as novas fitas de DNA sintetizadas têm início a partir desse iniciador.
II – O resultado final da PCR é a amplificação de uma região específica do DNA.
III – ATaq polimerase, DNA polimerase extraída da bactéria Thermusaquaticus, é uma das limitações da PCR, por ser termossensível, sendo necessário ser adicionada a cada ciclo da reação.
Estão certos apenas os itens:
(A) I e II.
(B) II e III.
(C) I, II e III.
Gabarito
1. Marcadores moleculares são geralmente, neutros em relação a efeitos fenotípicos, com mínimo ou nulo efeito. Já marcadores morfológicos muitas vezes coíbem ou restringem o desenvolvimento normal da planta e seu controle genético pode afetar, ou ser afetado, por genes controlando outros caracteres.
2. S = 23. Estão todas corretas.
3. Letra C.
Referências Bibliográficas
PIMENTEL, M. M. G.; GALLO, C. V. de M.; SANTOS-REBOUÇAS, C. B. Genética Essencial. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013.
GELAPE, F.F. Marcadores Genético Moleculares aplicados a programas de conservação e uso de recursos genéticos. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados. 200
Nenhum comentário:
Postar um comentário